——MP Biomedicals描述了以高产量和活力分离单核和多形核白细胞的制剂——
从血液中分离存活的单核和多形核细胞是广泛的免疫学和细胞生物学研究的起点。与红细胞和血小板不同，所有白细胞都是有核的，并且可以通过其核结构分类为单核或多形核细胞。
淋巴细胞和单核细胞是免疫系统中具有单叶核的单核白细胞的两个主要类别，可以保护机体免受感染，癌症和其他外来入侵者的侵害。在人类中，淋巴细胞占外周血单核细胞（PBMC）人口的大部分（70–90％），其次是单核细胞（10–30％）和一小部分的树突状细胞（1-2％）。与单核白细胞不同，多形核白细胞的核形状各不相同，通常分为三个部分。中性粒细胞是最丰富的多形核白细胞，而其他类型（嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞和肥大细胞）的种群要少得多。
对于许多免疫和细胞培养工作流程，第一步是从血液中特异性分离白细胞。分离白细胞的早期方法涉及将血液与一种聚集红细胞的化合物混合，而后者的聚集程度要小得多。离心后，这些聚集的红细胞由于密度更高而沉淀并形成沉淀，而白细胞则保留在溶液中。但是，使用这种方法回收白细胞可能无法令人满意。细胞可能被聚集的红细胞捕获并沉淀，对分离出的细胞造成广泛的损害。
1968年，Bøyum通过使用菲科尔-甲磺酸钠溶液进行离心分离，推出了一种更方便，更快速的分离方法。1这种分离方法利用了全血中各组分的细胞密度差异，当在密度梯度介质中离心时，它表现出通过介质的独特迁移模式，从而可以分离出不同的细胞群。整个过程在较低的重力场下进行，而无需引入聚集试剂，因此可以保持细胞活力。
许多研究人员的一个痛点是如何从血液中特异性地分离出单核和多形核细胞，从而获得高产量和活力。MP Biomedicals提供三种产品，用于从人外周血以及从骨髓和脐带血中分离单核细胞和多形核细胞。这些分离产物允许用户使用细胞分选或类似技术获得可作为进一步分离特定细胞的起点的细胞级分。
作为MP Biomedicals的前身，ICN Biomedicals是最早引入用于淋巴细胞分离的商用即用试剂盒的公司之一。自20世纪70年代初，淋巴细胞分离液（LSM™），LymphoSep®，和单聚®解决中已经使用了由世界各地的研究人员很多应用。
单核细胞分离仅用于研究
MP Biomedicals生产的经过优化的LSM具有独特的配方，其中泛影酸钠成功替代了甲磺酸钠。LSM不仅可以从人的外周血中分离淋巴细胞，而且还可以从骨髓以及脐带血中分离出淋巴细胞。每100 mL溶液中密度为1.077–1.080 g / mL，其中包括6.2 g Ficoll和9.4 g泛影酸钠。
LSM设计用于在一步离心中确保单核细胞的最大产量，并具有超过96％的淋巴细胞细胞活力。（LSM用于从其他血液成分中分离淋巴细胞的分离原理总结于图1中。）这种经过时间考验和验证的分离介质已在2200多种科学出版物中引用。
图1.使用淋巴细胞分离培养基（LSM）从全血中分离单核细胞。
- 从人外周血中分离单核细胞：Liu等。分离自轴突性脊柱关节炎患者和健康对照者外周血中的单核细胞，以研究血液源性巨噬细胞中肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（TNFAIP3）的差异调节。2该研究表明，用LSM分离的单核细胞保留了其分化能力，并可以产生功能性巨噬细胞集落刺激因子衍生的巨噬细胞，用于免疫学研究。
- 从大鼠脾细胞中分离单核细胞：LSM也已成功地用于从啮齿动物中分离淋巴细胞，即使来自啮齿动物的淋巴细胞的平均密度比人类的略高。在最近的一项研究中，研究了急性心肌梗塞后间充质干细胞（MSC）衍生的外泌体对血管生成和抗炎活性的旁分泌作用。3在这种情况下，使用LSM分离大鼠脾淋巴细胞以进行T细胞增殖测定，以评估MSC来源的外泌体的血管生成能力。
- 从粪便或血液中分离出寄生虫：LSM已被证明可有效地从外周血样本中分离出寄生虫。淋巴丝虫病是一种由蚊子传播的热带病，由丝状线虫引起，例如马来亚布鲁吉（Brugia malayi）。蚊子会摄入微丝虫（Mf）或第一阶段的幼虫，这些蚊子可通过蚊虫叮咬感染人类。Schroeder等。成功地利用LSM从感染沙鼠的血液中分离了Mf。4Mf与人脐静脉内皮细胞共培养，以研究Mf螯合在感染个体肺部的机制。
淋巴细胞分离用于体外诊断
LymphoSep淋巴细胞分离培养基基于高度优化的Byyum制剂，该制剂最初设计用于从稀释的全血中体外分离淋巴细胞。其密度为1.077 g / mL。LymphoSep已通过体外诊断（IVD）的使用验证，并被美国食品和药物管理局（FDA）指定为I类医疗设备，该设备作为淋巴细胞分离介质免于FDA上市前通知要求（21CFR864.8500 ）。与LSM一样，LymphoSep可通过一步离心提供高产量的淋巴细胞，细胞活力超过96％。
去纤维化或肝素化的血液样本首先用生理盐水或平衡盐溶液按1：1比例稀释，铺在分离介质上，并以约400 g的低速离心15–30分钟。在离心过程中，血液成分有差异地迁移到几层。
当将LymphoSep用作分离介质时，形成的层类似于使用LSM时形成的层（图1）。它们从上到下如下：血浆和其他成分；所谓的血沉棕黄层（其中包含淋巴细胞和单核细胞等细胞）；分离介质 沉淀物（在圆锥形管的最底部以沉淀的形式），其中包含粒细胞和红细胞（红细胞）。为了分离PBMC，提取血沉棕黄层，用盐缓冲溶液洗涤，然后离心，以小体积高收率回收细胞。除去含有血小板，分离介质和血浆的上清液，留下纯化的PBMC沉淀。这些细胞然后可以用于生命科学应用，例如流式细胞仪，细胞分选，细胞培养和测序程序。
多形核细胞分离
通常，研究人员希望做的不仅仅是分离单核细胞群。当需要从血液中分离单核细胞和多形核细胞时，可以使用单聚解析培养基（M-PRM）。它是专为在一步离心中从污染红细胞中最佳分离单核淋巴细胞和多形核白细胞而设计的。M-PRM是由多糖（Ficoll 400）和不透射线的造影剂（Hypaque）按特定比例组成的溶液，其密度为1.114±0.002 g / mL。
离心前，将未稀释的，经过抗凝剂处理的血液铺在M-PRM上（图2）。离心过程中的差异迁移可将单核和多形核白细胞解析为两个相对不带红细胞的条带。
图2.使用单聚分辨培养基（M-PRM）从全血中分离单核细胞和多核细胞。
各种实验室的典型结果表明，通过台盼蓝染料排除法评估，M-PRM上的血液分离可以实现> 90％的白细胞回收率和> 99％的生存力。通常，顶部白细胞带（组分1）包含94-98％的单核细胞（淋巴细胞和巨噬细胞），而第二个（组分2）包含96-99％的多形核白细胞。
已显示通过该系统分离的单核和多形核白细胞都保留功能特性。特别是，使用M-PRM分离的多形核细胞比通过其他方法制备的多形核细胞具有更好的功能能力。例如，M-PRM已用于从血液中分离嗜中性粒细胞，用于各种免疫学研究。这些吞噬性粒细胞通过摄取和/或释放杀死微生物的酶起作用，是抵抗感染的第一道防线。它们是先天免疫系统的重要组成部分。
单核细胞和多形核细胞的分离通常是目标细胞分选和分离程序中的第一步，也是最关键的步骤。它可以为后续步骤提供可行的细胞群体，这些步骤通常采用基于磁珠的系统或流式细胞仪。如果起始原料是高度富集的馏分而不是全血，则靶向分离将更有效且更具成本效益。由于感兴趣的细胞亚群在样品大小和体积有限的情况下极为罕见，因此从您选择的标本中获得最高产量的活细胞而不引起功能退化至关重要。
李尚豪博士（Shanghao.Li@mpbio.com）是加利福尼亚州圣安娜市MP Biomedicals公司免疫学和细胞生物学全球产品经理。Micic Miodrag博士，博士，是加利福尼亚州圣安娜市MP Biomedicals公司的首席营销官。他还是加利福尼亚州诺沃克市塞里托斯学院的工程设计技术教授和系主任。他曾任MP Biomedicals公司研发副总裁。
参考文献
- BøyumA.从人血中分离单核细胞和粒细胞。已扫描。J.临床 实验室 投资。1968年；21（Suppl。97）：77–89。
- 刘Y，等。遗传和功能关联与减少的抗炎性肿瘤坏死因子α诱导的轴突性脊柱关节炎患者巨噬细胞中的蛋白质3。面前。免疫 2017; 8：860。
- Teng X等。间充质干细胞衍生的外泌体改善了梗塞心肌的
微环境，有助于血管生成和抗炎。细胞。生理学。生化。2015; 37：2415-2424。 - Schroeder JH等。马来布鲁氏丝虫以C3依赖性方式粘附于人血管
内皮细胞。PLoS Negl。放下 Dis。2017; 11：e0005592。
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