Staining Cell Surface Targets For Flow Cytometry 细胞表面抗原免疫荧光染色(流式分析)

  • 杨, 梅艳
  • 2019年8月12日
  • 技术专栏
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Staining Cell Surface Targets For Flow Cytometry

细胞表面抗原免疫荧光染色(流式分析)

产品标签:

Cell surface antigen 细胞表面抗原;RBC Lysis Buffer 红细胞裂解液;TruStain FcX™ Fc受体封闭剂;Flow cytometry(FC)流式分析;cell staining buffer 细胞染色缓冲液;

背景描述:

通过荧光标记抗体和流式细胞术检测,细胞表面标记(Cell surface marker)能够用来确定细胞亚群,基于来源,发育阶段和功能。这些表面标记呈现不同形式和功能,包括识别可溶性和细胞连接配体的受体,离子通道,糖蛋白,磷脂等。比如CD4是辅助性T细胞(Th细胞)的表面标记,基于其他趋化因子受体和白细胞分化抗原标记能进一步被分类鉴定。

细胞表面抗原免疫荧光染色-流式分析步骤:

此步骤做交流学习用,具体的实验方案因实验而异。

A.组织和细胞收集

1. 收集理想组织(如脾脏、淋巴结、胸腺、骨髓)并制备悬浮于细胞染色缓冲液(cell staining buffer)的单细胞悬液。如果使用体外刺激细胞,只需将刺激活化的细胞简单悬浮于细胞染色缓冲液(cell staining buffer)。

2. 加细胞染色缓冲液(cell staining buffer)高达~15ml,然后350xg离心5min,吸掉上清。

B.红细胞裂解

3. 用3ml红细胞裂解液(1× RBC Lysis Buffer)重悬细胞或根据具体情况加入相应量的红细胞裂解液。冰上孵育5min。

4. 加10ml细胞染色缓冲液(cell staining buffer)到管内终止细胞裂解,然后350xg离心5min,吸掉上清。

5. 如步骤2重复一次清洗。

6. 细胞计数,用细胞染色缓冲液冲重悬细胞使浓度为5-10 x 106cells/ml,按照100µl/管分装细胞悬液到12 x 75mm塑料管中(5-10 x 105cells/ml)。

C.Fc受体封闭

7. 阻断Fc受体的试剂适用于降低非特异性免疫荧光染色。小鼠样本,使用特异性结合FcγR III/II的TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32)抗体可用于封闭抗体的非特异性染色。此种情况下,100 µl染色体积按照每106个细胞加入1µg TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32)抗体,混匀,冰上孵育5-10min。

8. 人样本,每100 µl染色体积加入5µl Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution,Fc受体封闭剂),混匀,室温孵育5-10min。在不含有有效/可得的封闭抗体情况下,使用过量的相同物种来源的纯化IgG和免疫荧光染色用抗体相同来源的IgG亚型作为替代方法来封闭细胞。

D.抗体的细胞表面染色

9. 按照预先优化的浓度,加入合适的荧光素、生物素偶联抗体或纯化的一抗(如:anti-CD3-FITC, anti-CD4-Biotin, and anti-CD8-APC),冰上避光孵育15-20min。

10. 至少使用2ml细胞染色缓冲液(cell staining buffer)清洗细胞,350xg离心5min,吸掉上清。重复一次。

11. 如果使用纯化的一抗,需在残留的缓冲液中重悬细胞,加入预先优化浓度的荧光二抗,冰上避光孵育15-20min。

12. 重复步骤10。

13. 用0.5ml细胞染色缓冲液(cell staining buffer)重悬细胞,每106个细胞加入5µl(0.25µg)7-AAD染色液(7-AAD Viability Staining Solution)对死细胞染色。

14. 避光冰上孵育3-5min。

15. 用流式细胞仪分析结果。

【注意】:如果不能立即使用流式细胞仪分析样品,避光保存样品,并且置于4-8℃保存。样品必须重悬于细胞染色液中。注意细胞样品不应该放在固定缓冲液更长时间,因其会影响荧光素构象和荧光信号。

实验用产品信息:

品牌 货号 名称 规格 价格(元)
MKbio MX1501-100ML Red Blood Cell Lysis Buffer 红细胞裂解液 100ml 120
MKbio MX1504-500ML Cell Staining Buffer 细胞染色缓冲液 500ml 250
MKbio MX1505-50T Fc Receptor Blocking Solution, Human

人Fc受体阻断剂(同Human TruStain FcX™)

50T 1060
Biolegend 422301 Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution) 50T 1190
Biolgend 422302 Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution) 200T 2730
MKbio MX4216-150T 7-AAD Viability Staining Solution 7-AAD细胞活力染色液 150T 150
BD Falcon 352063 5ml圆底试管(流式管)12X75MM聚丙烯锁扣帽 25个/包 56
BD Falcon 352063 5ml圆底试管(流式管)12X75MM聚丙烯锁扣帽 500个/箱 732

注意事项

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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