根癌(发根)农杆菌感受态细胞技术专题

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  • 2019年7月31日
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根癌农杆菌感受态细胞(EHA101,EHA105,LBA4404,GV3101,AGL1) 发根农杆菌感受态细胞(MSU440,C58C1,K599,Ar A4,Ar.Qual,Ar 1193)

基本概念:

农杆菌(Agrobacterium)是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌,常见的有两种:根癌农杆菌(A. tumefaciens)和发根农杆菌(A. rhizogenes)。根癌农杆菌能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物或裸子植物的受伤部位,诱导产生冠瘿瘤。诱发冠瘿瘤的原因在于根癌农杆菌Ti质粒上的T-DNA含8个左右的基因能在植物细胞内表达,指导合成一种非常特殊的化合物冠瘿碱,进而引发转化细胞癌变;而发根农杆菌能诱导产生发状根,特征在于大量增生高度分支的根系。根癌农杆菌Ti质粒(150~200kb)和发根农杆菌Ri质粒(200~800kb)上的一段T-DNA,当农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,Ti质粒或Ri质粒上的T-DNA区脱离质粒而整合到植物基因组。

正因如此,农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系,能通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合,并通过细胞和组织培养技术,得到转基因植物。这就是农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation)。目前,此方法不仅在实验室中普通用于双子叶植物的感染,还成功用在非农杆菌寄主生物,比如真菌,单子叶植物,裸子植物甚至动物细胞等的转化。目前得到普遍应用,特别是植物的转基因工程研究。

操作流程(农杆菌转化法):

农杆菌介导的转化(Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation)涉及多个步骤:1)从起始物种中分离感兴趣基因;2)建立功能性的转基因构建子包括感兴趣基因、驱动表达的启动子、密码子修饰(若是需要以提高成功的蛋白表达)、筛选基因(便于筛查出成功转入目的基因的宿主植物);3)将转基因插入到Ti质粒上;4)将含T-DNA的质粒转化进入农杆菌;5)将转化后的农杆菌与植物细胞混合,从而允许T-DNA整合进入植物染色体;6)遗传工程成功改造的植物体再生;7)在实验室、温室和大田水平来测试转基因表达效果。见图1,根癌农杆菌介导的植物转化示意图。

植物转化用T-DNA双元载体(质粒):

双元载体系统(Binary-vector system)是植物基因工程常用的载体系统。

双元载体系统包含两个不同的质粒:一种是野生宿主源的小复制子(wide-host-range small replicon),含有一复制起始点(ori),能够让质粒在包括大肠杆菌和农杆菌在内的细菌内维持生长,这类质粒通常含有a)替换T-DNA的外源DNA;b)T-DNA左右边界序列(或至少含T-DNA右边界);c)同时维持和筛选大肠杆菌和农杆菌的标志基因;d)植物生长的筛选标志基因;一种是辅助型Ti质粒(helper Ti plasmid),缺乏完整的T-DNA区域,但是含有完整的vir区,能够激活T-DNA的转移。